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Institut für Sicherheit und Qualität bei Obst und Gemüse

Mykotoxinbildung im Lebensmittel

Quantifizierung von Penicillium verrucosum RNA mittels ddPCR nach Wachstum auf Weizens ddPCR und Bestimmung der positiven und negativen Tröpfchen
Quantifizierung von Penicillium verrucosum RNA
mittels ddPCR nach Wachstum auf Weizens ddPCR.
A: Bestimmung der positiven (blau) und negativen Tröpfchen
Aktivierung der Expression eines biosynthetischen Gens der Mykotoxinbildung (Ochratoxin) bei Erhöhung der Temperatur von 15 auf 25 °C
B: Aktivierung der Expression eines biosynthetischen
Gens der Mykotoxinbildung (Ochratoxin) bei Erhöhung
der Temperatur von 15 auf 25 °C.

Molekulares Monitoring

Mykotoxine sind giftige Stoffwechselprodukte von Pilzen. Sie werden für deren Wachstum nicht unbedingt benötigt, es scheint aber, dass sie die Anpassung an bestimmte Umweltbedingungen, fördern können. Ein Pilzbefall muss nicht zwingend mit Mykotoxinbildung einhergehen. Die Herausforderung ist daher, die Bedingungen für die Bildung von Mykotoxinen zu identifizieren.

Wenn Pilze pflanzliche Produkte befallen, können selbst nach der Ernte noch Schutzreaktionen der Pflanze erfolgen. Dies kann wiederum zu einer gesteigerten Mykotoxinbildung führen. Dabei beeinflussen abiotische Faktoren wie Temperatur oder Wasseraktivität die Bildung der Pflanzengifte.   In der Regel führen tiefe Temperaturen und eine geringere Wasseraktivität zu einer Verringerung des Wachstums von Pilzen und zu einer Verringerung der Mykotoxinbildung. In Situationen in denen aus Gründen der Produktqualität, bzw. Energiekostengründen, die Temperatur bzw. Wasseraktivität nur soweit gesenkt werden kann, dass Pilze im Wachstum zwar reduziert aber nicht vollständig gehemmt werden, kann es entsprechend auch zu einer Steigerung der Mykotoxinbildung kommen. Die beiden Parameter Temperatur und Wasseraktivität werden besonders bei der Lagerung eingesetzt um pflanzliche Produkte länger haltbar zu machen.

In einem aktuellen Projekt (AflaNet) sollen in Zusammenarbeit mit afrikanischen Partnern und weiteren Instituten des MRI molekulare Monitoring Systeme für die Bildung von Aflatoxin in Mais unter realistischen Lagerungsbedingungen erarbeitet werden. Aflatoxin wird hauptsächlich durch die Pilze Aspergillus flavus und Aspergillus parasiticus gebildet. Aflatoxin ist sehr toxisch und stellt ein großes Problem der Lebensmittelsicherheit dar. Dies gilt in besonderem Maße für verschiedene afrikanische Regionen. Ein Ziel des Projektes ist die Entwicklung einer „Heatmap“ in der die Gefahr der Aktivierung von aflatoxinbiosynthetischen Genen, bzw. die erwünschte Inaktivierung von diesen Genen, in Bezug zu den Bedingungen im pflanzlichen Produkt aufgezeigt wird.

Um Lagerungsbedingungen zu optimieren, ist eine genaue Kenntnis über die Ursachen und die Regulation der Mykotoxinbildung von großer Bedeutung. Werden die gebildeten Mykotoxine mittels analytischer Verfahren nachgewiesen, bekommt man den Status Quo über die toxikologische Sicherheit eines bestimmten Produktes, kann aber nichts über die Bedingungen aussagen, die zu der Bildung geführt haben. Voraussetzung für die Synthese der Mykotoxine ist die Aktivierung der biosynthetischen Gene. Diese Aktivierung erfolgt immer vor der analytisch messbaren Mykotoxinbildung, kann also als frühes Signal für ebendiese angesehen werden. Die Aktivierung von Genen kann durch moderne Analyseverfahren, wie die Microarray-, Real Time PCR- oder ddPCR Techniken (Droplet Digital PCR), gemessen werden. Diese drei Verfahren sind im Institut für Sicherheit und Qualität bei Obst und Gemüse etabliert. Besonders die ddPCR zeichnet sich durch Sensitivität und Unempfindlichkeit gegenüber probenbedingten Verunreinigungen aus. Es handelt sich dabei um ein neues PCR Verfahren, mit dem bestimmte Bereiche der Erbsubstanz von Pilzen (und anderen Organismen) quantifiziert werden können. Das Besondere dieses Verfahrens ist dabei die Aufteilung der Reaktion in eine Vielzahl von Nanotropfen (droplets), die theoretisch jeweils nur ein  DNS Molekül enthalten. Durch diese starke Verdünnung werden Verunreinigungen, die zu einer Störung der Reaktion führen würden, weitgehend vermieden. Nanotropfen die DNS enthalten, zeigen eine Reaktion und werden durch einen Farbstoff markiert. Nanotropfen die keine DNS enthalten, werden nicht markiert. Die Anzahl markierter und nicht markierter Tropfen wird ermittelt. Aus dem Verhältnis kann auf die Anzahl an DNS- oder RNA-Molekülen geschlossen werden, so dass das Wachstum des Pilzes und die Expression biosynthetischer Gene direkt im Produkt verfolgt werden können. Dies ermöglicht sehr genaue Aussagen über die Voraussetzungen, die zur Mykotoxinbildung führen. 

Im Rahmen des AflaNet Projektes ist es gelungen ein ddPCR System zu entwickeln, das die Aktivität eines Gens, das die Aflatoxinbildung steuert (aflR), detektieren kann. Erste Versuche haben gezeigt, dass die Aktivierung dieses Gen erst ab einem bestimmten Zeitpunkt des Wachstums von A. flavus auf Mais sehr intensiv auftritt. Diese Aktivierung ist von einer deutlich erhöhten Aflatoxinbildung begleitet. Dieser Aktivierungspunkt kann daher als ein möglicher Kontrollpunkt für die Aflatoxinbiosynthese angesehen werden. Gelingt es diese Aktivierung durch Veränderung der Bedingungen zu unterdrücken, kann die Aflatoxinbildung kontrolliert werden.

Weitere ddPCR Systeme sind in Bearbeitung. Diese sollen zum Monitoring von Penicillium verrucosum oder Penicillium expansum eingesetzt werden. Letzterer spielt besonders als Verderbsorganismus von Äpfeln eine Rolle. Beides sind wichtige mykotoxinbildende Pilze. Mit Hilfe der ddPCR konnte hier der Einfluss der Temperatur auf die Genexpression und Toxinbildung charakterisiert werden.

Projekt

Minimization of aflatoxin contamination in the value chain, BML, 01. 07. 2016 – 31. 07. 2017