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Authentifizierung

Huhn oder Fasan – das ist die Frage

Weiße Hühner

Eindeutige Identifizierung von Tierarten

Am 28. Januar 2002 trat das Europäische Lebensmittelgesetz (EU-Verordnung 178/2002) in Kraft. Artikel 18 dieser Verordnung regelt seit dem 01. Januar 2005 die Rückverfolgbarkeit von Lebensmitteln. Eine Grundvoraussetzung der Rückverfolgbarkeit ist die Authentizität der Ware. Gerade beim Fleischeinkauf ist dies für den Verbraucher nicht immer leicht ersichtlich.
Die eindeutige Identifizierung von fünf in Europa häufig als Lebensmittel genutzten Geflügelarten – Huhn, Pute, Fasan, Wachtel und Perlhuhn – ist eine  Herausforderung. Zum Einsatz kommen hier DNS-analytische Methoden. Zur Identifizierung mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden sowohl bereits in der Literatur beschriebene Primersysteme auf ihre Spezifität getestet, als auch neue Primersysteme entwickelt. Als Grundlage für die tierartspezifischen Primer diente das mitochondriale Cytochrom-b-Gen. Die DNS-Sequenzen zur Erstellung der geflügelspezifischen PCR-Systeme für Pute, Fasan, Wachtel und Perlhuhn wurden über Gendatenbanken ermittelt. Für die Geflügelart Huhn wurde ein PCR-System der Literatur entnommen. Sequenzvergleiche erfolgten mit Hilfe von  Nucleotidsequenzdatenbanken. Die erhaltenen Primersysteme wurden zunächst in  Polymerase-Kettenreaktionen mit anschließender Darstellung der Amplifikationsprodukte durch Gelelektrophorese eingesetzt.
Um zu überprüfen, ob die verwendeten Primersysteme tatsächlich nur bei den jeweiligen Geflügelspezies positive Ergebnisse erzielen (Spezifität), wurden sie gegen die jeweils anderen untersuchten Geflügelarten sowie Rind, Bison, Schaf, Ziege, Pferd, Känguru und Strauß auf Kreuzreaktionen getestet.
Der Nachweis wurde als positiv gewertet, wenn das spezifische PCR-Produkt nach Gelelektrophoreseund Anfärbung mit Ethidiumbromid sichtbar war.

Aufbauend auf den erhaltenen Ergebnissen wurde ein Pentaplex-Real-Time-PCR System entwickelt. Passend zu jedem Primersystem wurden geeignete fluoreszenzmarkierte Sonden eingesetzt. Basierend auf der TaqMan-Technik kamen die Fluorophore ROX, JOE, FAM, DY682 und ATTO633 sowie die Black Hole Quencher 1 und 2 zum Einsatz. Das so entwickelte Pentaplexsystem wurde bezüglich Spezifität, Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit an verschiedenen Fleischerzeugnissen erprobt.
Auf Grund der zum Einsatz kommenden Real-Time-Multiplex-Technik ist es möglich, alle fünf Spezies in einer einzigen Analyse nachzuweisen. Obwohl die Auswahl von Cytochrom-b als Zielgen eine absolute Quantifizierung des Anteils der jeweiligen Spezies nicht erlaubt, ist jedoch eine ungefähre Abschätzung mittels dieser Technik möglich.
Die vorgestellte Analysenmethode stellt ein wichtiges Instrument zur Überprüfung der Deklaration von Fleisch und Fleischerzeugnissen dar. Aufgrund der hohen Spezifität des Nachweises kann die vorgestellte Real-Time-PCR-Methodik als zuverlässig eingestuft werden.

Spezifischer Nachweis der Tierart Perlhuhn in einer Perlhuhn-Terrine