Mykotoxinbildung im Lebensmittel

Molekulares Monitoring

Mykotoxine sind giftige Stoffwechselprodukte von Pilzen. Sie werden für deren Wachstum nicht unbedingt benötigt, es scheint aber, dass sie die Anpassung an bestimmte Umweltbedingungen, fördern können. Ein Pilzbefall muss nicht zwingend mit einer Mykotoxinbildung einhergehen. Die Herausforderung ist daher, die Bedingungen zu identifizieren, die zu einer aktiven Bildung von Mykotoxinen in Lebensmitteln führen.

Wenn Pilze pflanzliche Produkte befallen, können selbst nach der Ernte noch Schutzreaktionen der Pflanze erfolgen. Dies kann wiederum zu einer gesteigerten Mykotoxinbildung führen. Dabei beeinflussen insbesondere abiotische Faktoren wie Temperatur, Licht, der pH-Wert und die Menge an verfügbarem Wasser (Wasseraktivität) die Bildung der Pflanzengifte (Phytoalexine). In der Regel reduzieren tiefe Temperaturen und eine geringere Wasseraktivität das Wachstum von Pilzen und somit häufig auch die Mykotoxinbildung. Auf diese Weise können pflanzliche Produkte länger haltbar gemacht werden. Werden Temperatur bzw. Wasseraktivität jedoch nur soweit gesenkt, dass Pilze im Wachstum zwar reduziert aber nicht vollständig gehemmt werden, kann es zu einer „Stress induzierten“ Steigerung der Mykotoxinbildung kommen.

In einem aktuellen multidisziplinären Projekt (AflaZ) des Instituts für Sicherheit und Qualität bei Obst und Gemüse werden in Zusammenarbeit mit afrikanischen Partnern, dem Julius Kühn-Institut, dem Friedrich-Loeffler-Institut, der Universität Koblenz-Landau und mehreren Instituten des MRI im Rahmen von umfangreichen Forschungsprogrammen nachhaltige und zielgerichtete Strategien gegen die Bildung des Mykotoxins Aflatoxin in Mais entwickelt und für eine Anwendung vorbereitet. Aflatoxin wird hauptsächlich durch die Pilze Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, sowie Aspergillus minisclerotigenes gebildet. Aflatoxin ist hochgiftig und stellt in Regionen mit warmem und feuchtem Klima ein großes Problem im Bereich der Lebensmittelsicherheit dar, insbesondere in verschiedenen afrikanischen Regionen. Ein Ziel des Projektes ist die Entwicklung einer „Heatmap“, in der die Aktivität von Aflatoxinbiosynthese-Genen bei verschiedenen Bedingungen im pflanzlichen Produkt aufgezeigt wird.

Um Lagerungsbedingungen für Lebensmittel zu optimieren, ist es wichtig die zelluläre Regulation der Mykotoxinbildung genau zu verstehen. Voraussetzung für die Synthese der Mykotoxine, ist die vorherige Aktivierung hierfür verantwortlicher Gene der Pilzzelle. Diese erfolgt immer bevor Mykotoxine analytisch messbar sind, kann also als frühes Warnsignal herangezogen werden. Die Aktivierung von Genen kann durch moderne molekularbiologische Analyseverfahren, wie Microarray , Real Time PCR- oder ddPCR-Techniken (Droplet Digital PCR), überwacht werden. Diese drei Verfahren sind im Institut für Sicherheit und Qualität bei Obst und Gemüse etabliert. Besonders die ddPCR zeichnet sich durch eine außerordentlich hohe Nachweisstärke und Unempfindlichkeit gegenüber Probenverunreinigungen aus. Es handelt sich um ein relativ neues PCR Verfahren, bei dem bestimmte Bereiche der Erbsubstanz quantifiziert werden können. Das Besondere dieses Verfahrens ist dabei die Aufteilung der Reaktion in eine Vielzahl von sogenannten  Nanotropfen (droplets), die theoretisch jeweils nur ein  DNA/RNA Molekül enthalten. Durch diese starke Verdünnung werden Verunreinigungen, die zu einer Störung der Reaktion führen würden, weitgehend vermieden. Nanotropfen die DNA/RNA enthalten, zeigen eine Reaktion und werden durch einen Farbstoff markiert. Nanotropfen die keine DNA/RNA enthalten, werden nicht markiert. Die Anzahl markierter und nicht markierter Tropfen wird ermittelt. Aus dem Verhältnis kann auf die Anzahl an DNA- oder RNA-Molekülen geschlossen werden, so dass das Wachstum des Pilzes und die Expression der Biosynthesegene direkt im Produkt verfolgt (molekular gemonitored) werden können. Dies ermöglicht sehr genaue Aussagen über die Voraussetzungen, die zur Mykotoxinbildung führen.  
 
Im Rahmen des AflaZ-Projektes, ist es gelungen, ddPCR-Systeme zu entwickeln, mit denen die Aktivität verschiedener Gene, bspw. des Gens, das die Aflatoxinbildung steuert (aflR), bestimmt werden kann (Abbildung 1). Es wurde gezeigt, dass die Aktivierung dieses Gens ab einem bestimmten Zeitpunkt des Wachstums von A. flavus auf Mais sehr intensiv ist und von einer deutlich erhöhten Aflatoxinbildung begleitet wird. Dieser Aktivierungspunkt kann daher als ein möglicher Kontrollpunkt im Rahmen eines Monitorings für die Aflatoxinbiosynthese angesehen werden. Gelingt es diese Gen-Aktivierung durch Veränderung der Lagerbedingungen zu unterdrücken, kann die Aflatoxinbildung kontrolliert werden.

Weitere ddPCR-Systeme sind aktuell in der Entwicklung. Diese sollen beispielsweise zum Monitoring von Trichoderma afroharzianum eingesetzt werden, einer mykoparasitischen Pilzspezies, die selbst keine bekannten Mykotoxine bildet und als sogenannte Biocontrol-Spezies gegen Mykotoxin-bildende Pilzarten wie Aspergillus flavus auf Maisfeldern in Kenya eingesetzt werden soll (Abbildung 2).